Script IV RT Kit With gDNA Eraser 反轉錄
Script IV RT Kit With gDNA Eraser是一種高效、穩定、快速并具有清除高達260ng基因組DNA污染能力的高溫逆轉錄系統，采用第四代高達60℃的全新高溫逆轉錄酶，可以通讀GC含量豐富，二級結構復雜的RNA模板，極大提高了逆轉錄效率和長度，CT值一般提早2-3個循環。Script IV RT Kit With gDNA Eraser 反轉錄
Script III RT Kit With gDNA Eraser
（Perfect for qPCR）
Script IV RT Kit With gDNA Eraser 反轉錄
目錄號:71614
產品內容
Components | 71614-50 50 rxns (20 μl/rxn) | 71614-100 100 rxns (20 μl/rxn) |
5x RT Mix IV | 200 μl | 400 μl |
4x gDNA Eraser Mix | 50 μl | 100 μl |
RNase free H2O | 1.5 ml | 1.5 ml |
保存條件
-20℃保存，有效期 12 個月。
產品簡介
Script IV RT Kit With gDNA Eraser是一種高效、穩定、快速并具有清除高達260ng基因組DNA污染能力的高溫逆轉錄系統，采用第四代高達60℃的全新高溫逆轉錄酶，可以通讀GC含量豐富，二級結構復雜的RNA模板，極大提高了逆轉錄效率和長度，CT值一般提早2-3個循環。
其中5x RT Mix IV為一管式逆轉錄預混液，含有逆轉錄所需的所有試劑（Script IV Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dTPrimer、dNTP Mixture、RT Buffer），并且，針對qPCR進行特別優化oligodT和N6隨機引物配比，使cDNA合成可從RNA轉錄本的各個區域起始并具有相同的逆轉錄效率，zui大程度保證了qPCR結果的真實性和可重復性。
適用范圍
第一鏈cDNA合成，尤其高GC含量，復雜模板的cDNA合成。可用于高拷貝、低拷貝基因的檢測。
注意事項
1． 建議使用 0.2ml RNase-free PCR 管在冰上配制反應液，并用 PCR 擴增儀精準控溫。
2． 為保證反轉錄成功，建議使用高質量的 RNA 樣品，及避免 RNase 污染。
3． 20μl 逆轉錄反應體系建議加入不超過 1μg 的 Total RNA。如果目的基因的表達量非常低，最多加入 5μg 。
4． 本產品適用于包含 Ploy (A)結構的真核生物 mRNA 和不包含 Ploy (A)結構的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不適用于miRNA等小 RNA 模板。
5． 5x RT Mix IV 和 4x gDNA Eraser Mix 比較粘稠，容易吸附在管壁和吸頭外，使用前，請先點甩離心。5x RT Mix IV 和 4x gDNA Eraser Mix 包含的酶過量，即使每次分別按照 3.8μl、0.9μl 使用，也不影響結果。
第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應體系為例)
重要提示：操作前，請將各組分輕彈混勻，點甩離心后置冰上備用。
1． 去除基因組DNA
于冰上，在PCR管中，加入以下組分：
Components | Volume |
Total RNA / mRNA | 50ng ~ 1μg / 5ng ~ 100ng |
4x gDNA Eraser Mix | 4 μl |
RNase-free H2O | To 16 μl |
用移液器輕輕吸打混勻，42°C 孵育 2 min，以去除基因組 DNA 污染。
2． 逆轉錄反應
把步驟1的反應管放在冰上，加入4 μl 5x RT Mix IV，輕柔吸打混勻，瞬離，設置反應程序：
① mRNA模板來源于真核細胞(植物、動物)，含有Poly(A)尾結構：50℃孵育15min；
② mRNA模板來源于原核細胞(細菌)、病毒，不含Poly(A)尾結構：25℃孵育10min；50℃孵育15 min。
注意：若模板具有復雜二級結構或高GC區域，把50°C的孵育溫度提升至55-60°C，
有助于提高產量。
3． 終止反應
85°C加熱5 sec，失活RTase和gDNA Eraser。
逆轉錄產物可立即用于qPCR反應，或保存于-20°C，并在半年內使用；長期存放，請分裝后存于-70°C。
qPCR
建議取1~2μl cDNA產物原液作為20μl qPCR反應體系的模板。如果基因表達量比較高，請根據實際情況適當稀釋cDNA模板后使用。
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