IDT NGS二代測序微小殘留病灶MRD解決方案
--文庫構建試劑盒、定制化Panel雜交捕獲探針組
北京云肽生物科技代理的IDTNGS二代測序DNA建庫試劑盒、定制化Panel(雜交捕獲探針組，為高效進行微小殘留病灶(MRD)實驗寬基礎研究握供了理想選擇。
一、背景介紹
微小殘留病灶(minimal residual disease, MRD)或分子殘留病灶(molecular residual disease)，是指癌癥患者經過手術gen治性治療后，傳統影像學或實驗室方法不能發現病灶，但通過基于二代測序(NGS)的液體活檢技術可檢出癌細胞分子的情況。實體瘤患者檢出微小殘留病灶MRD代表癌細胞在體內持續存在，癌癥復發風險高。微小殘留病灶MRD在多種實體瘤中都具有很好的預后價值。
2021年初，結腸癌NCCN2021.V2版指南出爐，在討論部分中新增了對外周血循環腫瘤DNA(CtDNA)檢測的描述。指南引用了三項臨床研究，其均采用了結合腫瘤組織測序的ctDNA檢測方案，論證了ctDNA指導的微小殘留病灶MRD方法提示結腸癌患者接受治療后復發可能的可行性。
目前實體瘤領域通過ctDNA檢測微小殘留病灶MRD的方法主要有兩類，分別是基于血漿檢測的tumor-agnostic方案(使用固定panel進行多位點覆蓋的ctDNA檢測)和基于組織先驗的tumor-informed方案(先對組織進行WES全外顯子測序以獲得信息，再個性化定制panel進行ctDNA超深度測序)。不同實體瘤的個體化差異巨大，panel的設計需要深思熟慮;早期實體瘤釋放到外周血中的cDNA量非常少，對檢測靈敏度要求非常高;ctDNA檢測作為病程管理的一部分，檢測的可重復性同樣至關重要;這些因素對微小殘留病灶MRD檢測在實體瘤中的應用帶來了巨大的挑戰。
二、IDT NGS二代測序解決方案
IDT可以提供豐富的產品組合，滿足從游離DNA樣本文庫構建到靶向捕獲的全套需求。
1、IDT xGen CfDNA&FFPE DNA文庫制備試劑盒
IDT xGen CDNA&FFPE DNA文庫制備試劑盒，支持對微量DNA樣本進行靈敏且準確的變異檢測。通過兩步連接法，可在獲得理想文庫轉化率的同時，抑制接頭二聚體的形成。在單鏈連接的過程中，可引入特異性的分子標簽(UMI)序列，以適配多種去重和錯誤校正的方法。現用低品質樣本建立高品質文庫，助力微小殘留病灶MRD研究。
優勢
①為困難樣本量身打造，更大化數據輸出;
②提升樣本轉化率，達到更高的文庫復雜度;
③結合UMI糾錯處理，實現低頻突變的檢測。
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圖.IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文庫制備試劑盒提供了非常高的轉化率和文庫復雜度，從而在目標區域獲得更好的覆蓋深度。使用10ng的cfDNA標準品并按照IDT提供的標準流程進行文庫制備，并用覆蓋16Kb的定制IDT xGen Custom Hyb Panels-Production 探針對文庫進行靶向捕獲。將捕獲后的文庫混合起來并在IIIumina Nextseq550測序儀上進行測序。采用BWA(0.7.15)對測序數據講行比對，并用Picard(2.18.9)進行覆蓋深度和復雜度(評估單一分子數，使用參數為HS文庫大小)的計算。
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圖.IDT xGED cfDNA&FFPE DNA文庫制備試劑盒提高對低頻突變的檢測靈敏度和特異性。使用25ng的cfDNA標準品按照IDT提供的標準流程進行文庫制備，標準品中突變基因的頻率(MAF)為0.25%。使用61kb的定制IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探針進行文庫捕獲，在測序后使用BWA(0.7.15)進行比對并按照IDT xGen cfDNA&FFPE試劑盒分析指南所述進行start-stop去重，或者按照combined read families的方法進行去重和錯誤校正。最后使用VarDict(1.5.8)識別變異。PPV=陽性預測值，足衡量突變檢出準確度的指標。
2、IDT xGen Custom Hyb Panels-Production 探針庫
DTxGen custom HvbPanels-Producion探針是帶有5端生物素標記的DNA探針，每一條探針均經過單獨合成、單獨質檢，可用于NGS二代測序中對目標序列進行富集。實驗證明，與通過微陣列合成的捕獲探針相比，IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探針實現的捕獲均一性更高，GC偏好性更少，能夠以更少的測序次數獲得更佳的測序深度。lDTxGen Custom Hyb Panels-Production探針庫可用模塊化的方式進行制備和使用，既可以獨立使用，也可以通過spike-in panel的形式與現有的探針庫結合使用，具有非常高的靈活性，是品質穩定、性能優異的捕獲探針選擇。
優勢
①單獨合成、單獨質控的探針，實現高效均一的目標富集:
②模塊化設計，實現經濟高效的定制和簡單輕松的目標點擴充:
③嚴格質控，降低批次間差異。
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圖3.使用IDT的探針庫實現高度均一的目標區域覆蓋。針對標準品基因組DNA(Coriell)構建文庫，使用lDT xGen Custom Hyo Panels-Production 探針庫進行捕獲反應(目標區域為88kb)。富集后的文庫在!uminaNextseq測序儀進行測序，對600K reads進行生信分析。結果顯示，(A)單次測序的覆蓋均一度較高;(B)同一個探針庫的兩個不同批次，顯示出較高的一致性。
三、成功案例
重慶lu軍軍醫大學西南醫院余佩武教授團隊，研究了基于ctDNA檢測的微小殘留病灶MRD水平與胃癌術后復發風險之間的聯系，其研究成果論證了cDNA作為新興的生物標志物在胃癌療效檢測和預后評估中的臨床意義。該研究中使用的定制捕獲panel采購自IDT。
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圖。圖中顯示了影像學結果，ctDNA水平與腫瘤標志物CEA在術后的動態變化，提示了ctDNA檢測在胃癌病人術后檢測中的潛在應用價值。
IDT為NGS靶向捕獲實驗提供端到端的產品覆蓋，并在精準性、經濟性和穩定性這三個方面具有顯著優勢。
①精確性:IDT埃豐富的UMI接頭選擇，結合以IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文庫制備試劑盒為代表的新穎的建庫方法，可大大提高樣本轉化率和檢測靈敏度;高質量的探針合成為高效檢測體細胞突變和甲基化水平打下了堅實的基礎，助力ctDNA的多維度研究。
②經濟性:IDT xGen Custom Hyb Panels-Accel探針庫進一步降低使用門檻，加快探針交付速度，讓新項目快人一步。
③穩定性:超過30年的寡核苷酸合成經驗，結合獨特的化學合成工藝和嚴格的質控方法，使IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探針組的表現穩定。
四、IDT微小殘留病灶MRD相關產品
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