IDT NGS二代測序微衛星不穩定性MSI解決方案
--文庫構建試劑盒、定制化Panel雜交捕獲探針組
北京云肽生物科技代理的IDT NGS二代測序產品，通過高質量文庫構建試劑盒、穩定的定制化Panel雜交捕獲探針組、對手動或自動化工作站的高通量處理支持，成為微衛星不穩定性(MSI)實驗室基礎研究的高效工具。
一、背景介紹
微衛星不穩定性(Microsatellite Instability，MSI)是指在DNA復制時由于重復單位的插入或缺失引起的微衛星(Microsatellite,Ms)序列長度改變的現象，常由錯配修復功能(Mismatch repair，MMR)缺陷引起。微衛星不穩定性MS!現象于1993年在結直腸癌中shou次發現。據MSI被檢測出的頻率可以分為三類：微衛星高度不穩定性(MS·H)、微衛星低度不穩定性(MSIHL)、微衛星穩定(MS·S)。隨著診療水平的進步和靶向藥物、免疫治療的出現，免疫檢查點抑制劑應用的越來越廣泛。MSI微衛星不穩定性是一種預測患者對免疫檢查點抑制劑反應的重要生物標志物，同也是一個泛癌種生物標志物，在腫瘤的診斷和治療中扮演著重要角色。
隨著高通量測序平臺的廣泛使用和二代測序NGS成本的降低，NGS平臺目標區域測序(NGS Panel)或WES全外顯子組測序逐漸也應用于微衛星不穩定性MSI的檢測中。NGS檢測通量大、靈敏度及持異性高，采用NGS Panel一次性可以檢測上千個MSI位點、錯配修復功能MMR基因狀態及其他分子標志物。同時，基于外周血循環腫瘤DNA(ctDNA)的MSI微衛星不穩定性的檢測，也為腫瘤組織取樣困難或不足的晚期實體瘤患者MSI檢測提供了新選擇。
二、
IDT NGS二代測序解決方案
1、IDT xGen cfDNA& FFPE DNA 文庫制備試劑盒
優勢
①提升樣本轉化率，達到更高的文庫復雜度；
②結合UMI糾錯處理，實現低頻突變的檢測;
③為困難樣本量身打造，更大化數據輸出。
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圖. IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文庫制備試劑盒提供了非常高的轉化率和文庫復雜度，從而在目標區城獲得更好的覆蓋深度。使用10ng的cDNA標準品并按照IDT提供的標準流程進行文庫制備，并用限蓋16kb的定制IDT xGen Custom HybPanels.Production 探針對文庫進行靶向捕獲。捕獲后的文庫混合起來并在lIIumina Nextseq550 測序儀上進行測序。采用BWA(0.7.15)對測序數據進行比對，并用Picard(2.18.9)進行覆蓋深度和復雜度(評估單一分子數，使用參數為HS文庫大小)的計算。
圖. IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文庫制備試劑盒提高對低頻突變的檢測靈敏度和特異性。使用25ng的cfDNA標準品按照IDT提供的標準流程進行文庫制備，標準品中突變基因的頻率(MAF)為0.25%。使用61kb的定制IDT xGen Custom HybPanels-Production探針進行文庫捕獲，在測序后使用BWA(0.7.15)進行比對并按照IDT xGen cfDNA&FFPE試劑盒分析指南所述進行stanrt-stop去重，或者按照combined read families的方法進行去重和錯誤校正。最后使用VarDict(1.5.8)識別變異。PPV=陽性預測值，是衡量突變檢出準確度的指標。
2、IDT xGen Custom Hyb Panels-Production 探針庫
IDT xGen Custom HvbPanels·Production 探針是帶有5'端生物素標記的DNA探針，每一條探針均經過單獨合成、單獨質檢，可用于NGS二代測序中對目標序列進行富集。實驗證明，與通過微陣列合成的捕獲探針相比，IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探針實現的捕獲均一性更高，GC偏好性更少，能夠以更少的測序次數獲得更佳的測序深度。IDT xGen Custom Hy b Panels·Production 探針庫可用模塊化的方式進行制備和使用，既可以獨立使用，也可以通過spike-in panel的形式與現有的探針庫結合使用，具有非常高的靈活性，是品質穩定、性能優異的捕獲探針選擇。
優勢
①單獨合成、單獨質控的探針，實現高效均一的目標富集;
②模塊化設計，實現經濟高效的定制和簡單輕松的目標靶點擴充;
圖3.使用IDT的探針庫實現高度均一的目標區域覆蓋。針對標準品基因組DNA(Coriell)構建文庫，使用lDT xGen Custom Hyo Panels-Production 探針庫進行捕獲反應(目標區城為88kb)。富集后的文庫在lllumina Nextseq測序儀進行測序，并對600Kreads進行生信分析。結果顯示，(A)單次測序的覆蓋均一度較高;(B)同一個探針庫的兩個不同批次，顯示出較高的一致性。
三、成功案例
研究人員使用了IDT xGen Exome Hyb Panel2 以及定制化的IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探針庫(包含150個癌癥相關基因)，進行了基于血漿樣本的微衛星不穩定MS!檢測的技術驗證和臨床驗證。這是國內通過臨床療效驗證的bMSI檢測，該研究同時也對中國18個癌種5000+例真實大樣本進行了MSI微衛星不穩定的檢測以及數據的總結。
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該研究對經PCR-MSI檢測確認的40例tMSI-H和209例tMSS晚期胃腸腫瘤患者的外周血進行技術驗證。該bMSI算法篩出33例tMSI-H患者和201例tMSS患者，與“金標準"組織PCR對照準確性達到94%(靈敏度:82.5%，特異性:96.2%)。
表.通過二代測序的方法檢測血液微衛星不穩定性(bMSI)與組織PCR檢測MSI(tMSI)時結果的一致性。
IDT為NGS靶向捕獲實驗提供端到端的產品覆蓋，并在精準性、經濟性和穩定性這三個方面具有顯著優勢。
①精確性:IDT埃豐富的UMI接頭選擇，結合以IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文庫制備試劑盒為代表的新穎的建庫方法，可大大提高樣本轉化率和檢測靈敏度;高質量的探針合成為高效檢測體細胞突變和甲基化水平打下了堅實的基礎，助力ctDNA的多維度研究。
②經濟性:IDT xGen Custom HybPanels·Accel 探針庫進一步降低使用門檻，加快探針交付速度，讓新項目快人一步。
③穩定性:超過30年的寡核苷酸合成經驗，結合獨特的化學合成工藝和嚴格的質控方法，使IDT xGen Custom Hyb Panels-Production 探針組的表現穩定。
四、IDT微衛星不穩定性MSI相關產品
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